做点突变经验总结

最近做点突变,走了不少弯路,在请教了实验室N多人之后,现在做起来也很顺手了。基本三天左右就能搞定。在这里把经验总结一下,留个备份。

1、设计引物,这个很重要,我之前就是在这一步上耽误了很长的时间。

可以去这个网站设计引物https://www.genomics.agilent.com/CollectionSubpage.aspx?PageType=Tool&SubPageType=ToolQCPD&PageID=15 是安捷伦公司的一个网页小工具,使用前要先注册。

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第一个第二个选项请忽视,在第三个的框里面填上你要突变的区域(只要包括有你要突变的位点的上下游各40bp的区域就可以。)

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然后点Upload now。

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在下面的框里面选择你要突变的位点,上面的选项里选择突变方式。如果你要做点突变,就在下面序列里选择你要突变的位点,然后在site1-7里面选择你想要突变成为的碱基,这个顺序就是你在序列里面选择的点的顺序。如果你想做缺失,就在下面选两个点,然后选择第二种突变方式,就会删除你选择的两个点之间的碱基,被选择的两个不会被删除。如果你想做插入,就在下面选两个点,然后选择第三种突变方式,在输入框里输入你想插入的点。

设置好之后点Design primers,引物就会出来。

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如果引物的Tm值在78度以上,基本突变的成功率会很高。

2、拿到引物之后,第一天,PCR,推荐使用KOD Plus高保真酶来做。使用25ul体系。

buffer 2.5ul ,dNTP 2.5ul ,MgSO4 1ul ,引物(F+R)2ul ,模板 100ng-200ng ,加水补至25ul。

updata:如果P不出来,可以加大dNTP和酶的量。

PCR程序是94度预变性 3分钟, 然后94度变性30秒, 68度延伸6分钟(时间根据1Kb1分钟的原则设定,可以适当延长30秒到1分钟。),扩增28个循环。(注意,没有单独的退火过程其实如果有影响也不大。)

3、酶切,直接在PCR产物体系里面加1ul的 Dpn I ,37度酶切 4个小时。然后65度10分钟使酶失活。

4、转化,取10ul酶切产物加到100ul感受态中。

5、第二天来实验室,你就会发现你的板长菌了,挑几个克隆,小摇。

6、小摇7个小时之后,基本就可以送测序了。

7、测序结果拿到之后,大摇,大抽,一个突变就做好了。

简单吧,快速吧!

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