做点突变经验总结

最近做点突变,走了不少弯路,在请教了实验室N多人之后,现在做起来也很顺手了。基本三天左右就能搞定。在这里把经验总结一下,留个备份。

1、设计引物,这个很重要,我之前就是在这一步上耽误了很长的时间。

可以去这个网站设计引物https://www.genomics.agilent.com/CollectionSubpage.aspx?PageType=Tool&SubPageType=ToolQCPD&PageID=15 是安捷伦公司的一个网页小工具,使用前要先注册。

image

第一个第二个选项请忽视,在第三个的框里面填上你要突变的区域(只要包括有你要突变的位点的上下游各40bp的区域就可以。)

image

然后点Upload now。

image

在下面的框里面选择你要突变的位点,上面的选项里选择突变方式。如果你要做点突变,就在下面序列里选择你要突变的位点,然后在site1-7里面选择你想要突变成为的碱基,这个顺序就是你在序列里面选择的点的顺序。如果你想做缺失,就在下面选两个点,然后选择第二种突变方式,就会删除你选择的两个点之间的碱基,被选择的两个不会被删除。如果你想做插入,就在下面选两个点,然后选择第三种突变方式,在输入框里输入你想插入的点。

设置好之后点Design primers,引物就会出来。

image

如果引物的Tm值在78度以上,基本突变的成功率会很高。

2、拿到引物之后,第一天,PCR,推荐使用KOD Plus高保真酶来做。使用25ul体系。

buffer 2.5ul ,dNTP 2.5ul ,MgSO4 1ul ,引物(F+R)2ul ,模板 100ng-200ng ,加水补至25ul。

updata:如果P不出来,可以加大dNTP和酶的量。

PCR程序是94度预变性 3分钟, 然后94度变性30秒, 68度延伸6分钟(时间根据1Kb1分钟的原则设定,可以适当延长30秒到1分钟。),扩增28个循环。(注意,没有单独的退火过程其实如果有影响也不大。)

3、酶切,直接在PCR产物体系里面加1ul的 Dpn I ,37度酶切 4个小时。然后65度10分钟使酶失活。

4、转化,取10ul酶切产物加到100ul感受态中。

5、第二天来实验室,你就会发现你的板长菌了,挑几个克隆,小摇。

6、小摇7个小时之后,基本就可以送测序了。

7、测序结果拿到之后,大摇,大抽,一个突变就做好了。

简单吧,快速吧!



wangfeng

从事医药研发工作,向往IT技术,喜欢折腾网站。

  1. Pingback: Christopher

  2. Pingback: Edwin

  3. Pingback: jack

  4. Pingback: Shannon

  5. Pingback: leslie

  6. Pingback: allen

  7. Pingback: rafael

  8. Pingback: Orlando

  9. Pingback: ivan

  10. Pingback: Alex

  11. Pingback: Ramon

  12. Pingback: Keith

  13. Pingback: arturo

  14. Pingback: Kurt

  15. Pingback: arthur

  16. Pingback: christopher

  17. 弱弱地问一下。。Tm值不是最好不要超过60度吗?我把这里设计的引物帖到Primer3Plus上面,里面说primer unacceptable,原因是Tm太高(安捷伦设计出来的Tm值79度),那到底这个primer还可不可以用呢?谢谢!

  18. 为什么总显示Warning: 2 illegal charachers were removed from the entered sequence,那个数字或者7,或者22的,到底是哪出了毛病,我也是只粘贴了要突变位点的上下游各40个bp啊

  19. 请问,安捷伦那个网页设计出来的引物,基本都是上下游引物完全互补,这样是不是容易形成引物二聚体,会不会影响实验? 我现在就卡在设计引物上了,希望能请教些具体的方法!

      • 我还想请教下,因为安捷伦这个设计出来的引物,不像primer5设计有很多自己可以调节的变量,安捷伦出来的引物 我放到primer5里看了下,primer显示的结果不是很好,是不是直接从安捷伦的网站设计出引物,不用修改,然后用KOD plus 扩增? 谢谢了!

        • 因为点突变的引物限制还是比较多的,一般就是在你突变位点上下游15bp这么长的地方,主要是很有限的调整一下tm值,其它的能调整的地方不多,不用管primer的评分的。